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DNA 甲基化研究，进来了解一下～
人阅读 发布时间：2018-04-17 15:53
DNA 甲基化（DNA methylation）是 DNA 修饰途径之一，即在甲基转移酶的催化下，DNA 的 CpG 两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成 5－甲基胞嘧啶（5-mC）。目前有大量研究证实，DNA 甲基化异常往往会引起染色质结构、DNA 稳定性等发生改变，抑制相关基因转录调控导致疾病发生，如肿瘤、血管类疾病、神经紊乱等。DNA 甲基化状态亦可作为疾病诊断、监测及预后的重要 Biomarker1，4，5，6。
小编粗略盘点了一下目前常用的几种 DNA CpG 甲基化检测方法，下面进入扫盲时刻：
- 亚硫酸氢盐处理+测序（BSP）：经过亚硫酸氢盐处理后，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；通过 PCR 扩增目的片段，并对产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断 CpG 位点是否发生甲基化。
- 甲基化特异性 PCR（MS-PCR）：在亚硫酸氢盐处理后，使用分别针对甲基化和非甲基化的序列设计的引物开展 MS-PCR，用电泳检测 MSP 扩增产物。若针对甲基化序列设计的引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化；反之则则说明该检测位点不存在甲基化。
- 甲基化敏感性限制性内切酶法（MSRE）：基于甲基化敏感 Ⅱ 型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理，酶切产物经电泳分离，探针杂交，扫描定量后得出原样本中甲基化的比例。
- 甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法（MS-HRM）：经亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化 DNA 存在序列差异，可通过熔解温度及峰型的变化区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。
- 焦磷酸测序（Pyrosequencing）：基于引物延伸的焦磷酸测序技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸（PPi）转化成光信号， 转换成一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。经重亚硫酸盐处理的序列可看作是 C>T SNP 位点。因此可凭借信号峰值高低来确定甲基化状态。
- 荧光定量法（Methylight）：利用亚硫酸氢盐处理 DNA 样本，设计分别针对待测序列甲基化和非甲基化状态的 Taqman 探针和引物进行荧光 PCR 扩增，以区分 CpG 甲基化和非甲基化状态。
上述几种方法各有优缺点，比如 BSP，结果可靠，精确度高，但需要大量的克隆，操作过程繁琐；MSRE，需要找到合适的酶切位点，受转化不彻底影响；MS-HRM，对仪器要求高，需要有 HRM 模块的荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 定量仪器均有此功能）；Pyrosequencing，过程复杂。
除此之外，还有高通量检测技术，如质谱、靶向测序、illumina450k、850k 芯片、Pacific Bioscience 的 SMRT 测序、Oxford Nanopore 测序等。
QX200 微滴式数字 PCR（ddPCR）技术以分子计数的方式实现对靶标核酸序列的绝对定量而不依赖标准曲线，且检测的灵敏度、重复性和准确性有很大提高。ddPCR 技术在癌症分子标志物发现、病毒载量分析、传染病研究、基因组结构变异及 NGS 文库定量等方面得到广泛应用。
而在 DNA甲基化研究方面 ddPCR 灵敏度更高，能在高丰度非甲基化背景下检测出甲基化序列，耐受前期处理带来的 PCR 抑制物的干扰，提高灵敏度，而且还能准确定量。接下来请看小编整理的三篇代表性文献：
1. ddPCR 技术准确检测 FFPE 样本甲基化状态 1
今年 3 月份发表在《Epigenetics》杂志上，Janssen Diagnostics 单位研究人员指出且指出相比传统的 qPCR Methylight 技术，ddPCR Methylight 技术可更加准确检测 FFPE 样本中极微量 DNA甲基化状态。
2. MS-NaME 方法处理后有利于微量甲基化变异的检测 3
这是一篇方法学文章，美国哈佛医学院研究工作着提出一种DNA甲基化前处理步骤——MS-NaME（Methylation Specific Nuclease assisted Minor-allele Enrichment），该步骤可提高后续检测技术（MS-HRM、Sanger 测序、ddPCR）的灵敏度，文章发表在《Nucleic Acids Research》杂志上。
数据结果：
a. Control 样本检测处理效果（MS-HRM 方法，1%、10%、40%M 比例，反之一样）
Ps：甲基化DNA 中含更多 CG，更难熔解，故上面每幅峰图中，左边是非甲基化状态，右边为甲基化状态
b． ddPCR Mathylight 检测更微量甲基化状态（因为 MS-HRM 和 sanger 测序方法都没办法检测 0.1% 的含量）
c．临床肺癌 cfDNA 样本，三种方法比较
很明显，即使没有预处理 ddPCR Methylight 技术，也是可检测出微量变化的。
3. 肝癌「身份指纹」——ctDNA甲基化状态 4
这篇文章厉害了，由中山大学肿瘤防治中心主任徐瑞华及美国加州大学张康教授领衔的团队共同合作，于 2017 年 10 月发表在《Nature materials》杂志（IF=39.737）上，研究指出 ctDNA 特定位点甲基化水平可作为肝癌诊断、疗效监测及预后 Biomarker，提高早期诊断准确率（以往标志物 AFP 仅 60%），帮助患者及时、准确发现。
文章亮点：
- 大量 Human 样本（1098 HCC vs 835 Control）
- 多种统计方法联用，筛选甲基化 Markers
- 高通量靶向测序、ddPCR 联用
更多精彩数据请查看原始文献…
Bio-Rad 公司早在 14 年就已经做过内部数据，采用 ddPCR 技术检测了 SNRPN Promoter 区域甲基化，结果显示可准确检测低至 0.5% 含量的甲基化水平（见下图，数据源于 Buletin6554）。
提问时刻：
1. 如何设计 ddPCR Mathylight 引物、探针？
A：下图中黑色加粗部分是 Primer 区域，框出部分是探针区域，FAM 靶向甲基化位点，HEX 靶向未甲基化位点。注：蓝色标记碱基是非甲基化胞嘧啶
2. 如何检测亚硫酸氢盐转化效率？
A：引物设计在没有 C 碱基的区域，这样可不受转化 or 未转化的影响，都能结合，但探针设计在含 CpG 岛位置，FAM 靶向转化状态，HEX 靶向未转化状态。
参考资料：
[1] Ole L, Lieven S. Droplet digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples. Epigenetics. 2018.
[2] Heidi D. Pharo, Kim A, Kaja C. G. Berg, Ragnhild A. Lothe, Marine J,Guro E. Lind. A robust internal control forhighprecision DNA methylation analyses by droplet digital PCR. Clinical Epigenetics. 2018;10:24.
[3] Yibin L, Chen S, Ioannis L, Mariana F.K, G. M.M. Methylation-sensitive enrichment ofminor DNA alleles using a double-strand DNA-specific nuclease. Nucleic Acids Research. 2016.
[4] Rui-hua X, Kang Z etc. Circulating tumour DNA methylationmarkers for diagnosis and prognosis of hepatocellular
carcinoma. Nature Materials. 2017.
[5] Yu,M., Carter,K.T., Makar,K.W., Vickers,K., Ulrich,C.M., Schoen,R.E., Brenner,D., Markowitz,S.D. and Grady,W.M. MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles. Epigenetics, 2015;10,803–809.
[6] Marisa M. F, Renecia A. W, Janice B, Carmella E, Naga C, Linda A. D, Kieren J. M, Sarah A. T, and Raghavendra G. M. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type1 Diabetes. Diabetes. 2015.
[7] Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ,Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use oflimiting dilution. BioTechniques. 1992;13:444–9.
Bio-Rad Bulletin6554.
本产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
Bio-Rad、ddPCR 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
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