马上要开组会了，小王同学愁眉苦脸，原来隔壁师兄因为被拒稿而延毕，起因是 qPCR 扩增曲线细节不符合标准，同病相怜的小王，究竟怎么才能让实验快速推进？



如果你觉得自己 qPCR 玩得飞起，那么 qPCR 界的老法师 Bio-Rad 可以帮你检验一下基本功，看你是否能够 100% 搞定 qPCR 实验。
 

一、qPCR 实验整体流程包括哪几个关键步骤？

 

 

 二、qPCR 实验常见技巧？




 

三、qPCR 实验常见问题？

 

3.1 Cq 值出现较晚，明显偏大（> 35）

 

 

1）模板量低或基因表达丰度低：建议增加模板量观察 Ct 值，观察其能否成相应倍数减少。

 

2）模板降解：重新制备扩增模板，重复实验。

 

3）qPCR 方法未优化或验证：整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。

 

4）扩增产物过长：建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过 300 bp。

 

5）反应体系存在抑制物：体系中可能存在抑制剂，影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

 

 

3.2 熔解曲线出现双峰，杂峰 Tm 在 80 ℃ 之前

 

 

1）可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等。

 

2）可能由于模板量过低，促使引物二聚体的形成，建议提高上样模板量。

如果前面的问题，你都答对了，那再考考你，知道 qPCR 实验的「圣经」——MIQE 指南吗？是不是被问住了。别急，下面老法师告诉你 MIQE 是什么。

 

MIQE 指南（qPCR 实验发布的最低限度信息的英文缩写），发表于 2009 年^[1]，该指南规定了获得可靠结果所需的最低限度的关键实验参数和注意事项，这是一个涵盖最佳实践和常识性理论，目前是 《Clinical Chemistry》中被引用次数第二多的论文。

 

MIQE 是一套准则，对 qPCR 实验所需的最少信息提出了要求，主要是一份涵盖 RT-PCR/qPCR 实验全流程的检查表（checklist），通过记录和提供所有 qPCR 相关的实验条件和结果，从而确保高质量的 qPCR 数据。

 

总之 MIQE 的最终目标是建立一个明确的框架，在此框架内进行 RT-qPCR 实验，并为审稿人和期刊编辑提供一个公认的标准，用于提高实验数据的透明度，评估待发表文章的质量，使用这种广泛应用的方法将最终产生更一致、更有可比性和更可靠的数据。


 

敲黑板了！！！

 

为什么要关注 MIQE 指南呢？你是否曾经尝试过论文中的新方案，却以失败告终？你并不孤单。Nature 杂志在一项调查中发现^[2]，大多数科学家都无法重现他们论文结果。MIQE 指南将提供指导，以确保您的出版物包含 qPCR 实验所有必要的细节，从而为其他研究人员提供复制您的结果的最佳机会，彻底杜绝被拒稿和撤稿的风险。

 

令人期待的是，Bio-Rad 公司一直在大力提倡和遵循 MIQE 指南的原则和理论，并发展出一套符合 MIQE 指南的 RT-PCR/qPCR 全流程实验方法，涵盖从实验设计到数据分析等 6 大实验环节。

 

Be the MIQE Star

今天我们正式邀请各位 qPCR 高手，赶紧学习、了解、掌握 MIQE 指南，并分享您如何遵从 MIQE 指南来开展 qPCR 实验的经验和技巧，欢迎向「Be the MIQE Star 」活动投稿，参与活动还有机会获得 ipad、 Airpods、星巴克咖啡机等礼品，多达 5 部 iPad 大奖等你来拿哦，奖品多多，期待您的精彩分享，继续书写 MIQE 的 success story！

活动详情
 

参与对象

• 中国大陆地区使用使用 RT-PCR（qPCR）的科研工作者。

• 此次活动不含临床医疗机构。

 

参赛要求

●作品主题：作品需与 MIQE、qPCR 相关实验流程以及 qPCR 结果有关，图片、文档或视频形式均可，并填写简要的作品描述。

●短视频类：不少于30s（建议5min之内），需要填写视频作品名字。建议围绕 qPCR 实验流程的某一环节，重点分享经验和 troubleshooting。图片类：上传图片以及添加不少于 100 个字的评论。文档类：重点推荐，请查阅投稿指南。

●参赛作品如涉及实验过程和结果，需要在任一品牌的荧光定量 PCR 上完成实验。

●加分项：提供 qPCR 实验细节、特色应用（基因编辑、甲基化分析、NGS、自动化工作流程、蛋白质热转移、熔融曲线、Micro RNA、非编码 RNA、单细胞、微量珍贵样本等）、已发表的文章、实验技巧、故障排除、录制 ≥20min 与 MIQE&RT-PCR 有关的视频等等。

●参赛作品需确保原创。

 

奖品及评奖规则

●MIQE Star of 2023：学习 MIQE 指南后的感受和体会；深入解读+评论 MIQE 周边相关的论述；补充 MIQE 指南尚未详细论述的内容等等，详情请查阅投稿模板；此奖项由 Bio-Rad 内部评审委员会对每一个作品打分产生，分数排名一名获得 iPad 10 奖品（含奖杯一个）；

● Best practice of MIQE：结合实例，分析 MIQE 指南的具体应用；分享如何在 MIQE 指南的指引下开展 qPCR 实验（比如实验设计中取样大小的估计、RNA 质量评估、Primer 设计与验证、qPCR assay 的优化与验证、内参基因的筛选和验证、合理的数分析流程等等），详情请查阅投稿模板；此奖项由 Bio-Rad 内部评审委员会对每一个作品打分产生，分数排名一名获得 iPad Air 5 奖品（含奖杯一个）；

●最佳人气奖：所有审核过的作品均可参与，由参与者自行转发、拉票，最后按点赞数量的高低进行排序，前 3 名获得 iPad mini 6（含奖杯各一个），第 4-6 名获得 AirPods 3rd ，第 7-10 名获得星巴克咖啡机 Genio S Plus，第 11-30 名获得 bilibili 1 年VIP 会员卡；

●参与奖：其它未获以上奖品的参与者，按照第一次投稿的时间，取前 200 名，将随机获得本子或雨伞。

 

注：每个参与者可以多次投稿，但只能获得一个奖品；如获奖，则以价值最高者为准。

 

免责声明：

●参赛者应自行确认获得了投稿视频和图片的著作权和相关人员的肖像权，投稿即表示授权活动主办方在相关活动及宣传中无偿拥有所投稿作品的使用权和发布权。

●如参赛者所提供的作品违反任何中国现行法律法规或者侵犯第三方合法权益而导致任何争议，索赔，诉讼等后果，由参赛者本人承担全部法律责任，活动主办方伯乐医学产品（上海）有限公司不承担任何法律责任。

●如因参赛作品侵权给活动主办方造成损失，参赛者应承担赔偿责任。投稿参与活动即视作参赛者同意以上声明。

 

活动流程

* 详细活动说明及要求可扫描活动海报二维码进入活动页面详细了解

 

如您想了解更多活动相关信息，或有任何疑问，欢迎咨询 george_gao@bio-rad.com。