qPCR实验避坑指南：9大常见错误与精准解决方案

• 制备含有所有反应成分（除模板外）的预混液母液，充分混合并分配到每个反应孔中。

• 准备足够满足配置所有反应的预混液母液，并额外多准备10%，以预防可能出现的移液误差。请勿冷冻和重复使用。

如果操作PCR管时不小心，扩增DNA很容易气溶胶化。进入反应容器或试剂中的污染物会影响最终数据，导致 “假阳性” 结果，与真实生物学信号混淆。

• 戴手套并在专用的qPCR区域工作

• 使用带螺旋盖的管子制备模板

• 始终使用专用移液器进行qPCR

• 使用防气溶胶带滤芯的吸头

• 使用PCR级水

• 提前计算好PCR成分，最好一次性使用完毕

• 用10%漂白剂而不是乙醇清洁工作台

• 实验过程中始终包含无模板对照

如何知道靶标序列是否被正确扩增？如果没有对照，您就无法确定检测的特异性和准确性，也无法在出现问题时排除故障。

如果阈值设置在PCR反应的指数增长阶段之外，Cq值将无法准确反映样本中的DNA浓度，其结果与生物学无相关性。

要在qPCR检测中实现准确的模板定量，每个反应都必须有效的扩增出单一产物。扩增效率不能受以下因素的影响：

• 模板浓度

• 其他模板的扩增

• 样本中潜在的污染物
  

即使采用商业化检测试剂，也应进行验证。

一定要验证新的qPCR检测方法，以验证其在测试条件下的扩增效率。

标准曲线用于确定qPCR检测方法的扩增效率、线性范围和重现性。这些值仅对用于生成标准曲线的系列梯度稀释内的浓度范围有效。如果样品的Cq值超出了系列稀释液的Cq值范围，则不能推断线性范围以外的扩增效率。

• 事先评估覆盖靶标预期浓度范围的一系列标准梯度稀释液

• 准备至少5个数量级的连续梯度稀释液（5-10倍）

• 为每个梯度稀释液移取相同体积的DNA

• 使用正确规格的移液器，尤其是小体积移液器

• 避免移液少于5µL

• 在检测污染物的阴性对照中用PCR级的水代替DNA

并非所有常用的参考基因在所有条件下都是表达稳定的。不确认参考基因的稳定性，可能会产生与所研究的生物学过程无关的结果。

对每个样品进行重复检测以评估测定方法的精密度和重现性，才能对检测和实验过程有信心。