伯乐生命医学产品（上海）有限公司 Bio-Rad Laboratories
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师姐支招！qPCR 数据也可以 10 分钟搞定，只用 2 个指标......
人阅读 发布时间：2023-05-31 10:13
典型的数据分析流程（图 1）包括：
1. 进行板间校正（如有的话），计算技术学重复的 Cq mean 值；
2. 计算相对表达量，这个表达量是相对于每个靶标的对照组而言，因此用对照组 Cq 值的平均值减掉处理组中每个样品的 Cq 值，即为 ∆Cq，扩增效率为标准曲线得到的 E；
3. 计算均一化的相对表达量。用目的基因的相对表达量除以均一化因子（如有多个参照基因，均一化因子即为其相对表达量的几何平均数）；
4. 计算生物组中的平均表达量，是组内每个样本的几何平均数；
5. 对生物组的平均表达量进行统计分析。注意，对象是平均表达量的对数形式，因为 Cq 值是符合正态分布的随机变量，而非表达量。示例中使用了 t 分布给出了 95% 的置信区间，也即使用 t 检验对对照组和处理组数据进行显著性分析。
图 1. 典型 qPCR 实验所需的严格的数据处理流程
当样品数量过多时不可避免会碰到多板数据合并的情况，要引入内部校正因子来尽量消除批次效应带来的误差。
目前很多实验室习惯于使用 Excel 中预先编制的公式来进行以上的数据分析，这个过程涉及大量数据的复制粘贴操作，并且 Excel 会对引入的数据流格式进行自动处理以匹配公式要求，这些操作都可能会引入误差，因此要格外小心。
为尽可能降低上述各种误差所带来的影响，遵循科学的实验设计流程（如图 2）是必要的。
图 2. 进行有效 PCR 实验所需要的方法[1]
步骤
第一步
也是最重要的，通过温度梯度筛选引物最佳 Ta，并结合熔解曲线分析，必要时加上扩增产物电泳分析来验证引物扩增的特异性（如图 7）；特异性良好时，扩增子应只有一个单峰，且 Tm 通常高于 80 ℃，区别于引物二聚体；
第二步
建立标准曲线确认扩增效率和动态范围，特别是检测下限，是否能覆盖可能的最低浓度的样本；扩增效率应该在 80～105% 之间，R2 > 0.98；
第三步
确认内参基因是否稳定表达，不受实验处理因素的影响，通常情况下建议使用 2 个及以上的内参基因。如没有合适的内参基因，则使用人为添加的外源性参照因子；
第四步
若实验中涉及需要多块孔板数据合并的情况，则建议使用 maximum samples per target 策略来布板，并设置板间均一化因子（Inter run calibrator）。这对于正确进行含多次运行的 qPCR 实验数据分析是必须的！
图 3. Inter-Run Calibration（IRC）实验设置。用于评估批间差校准效果的样本布局。
使用样本最大化的方法，在 1.5 块板上对 11 个样本的 6 个基因进行分析（右）。在基因最大化的情况下（左），需要 IRC（S1、S2、S3），以便将 S5-S7（板 1）与 S8-S11（板 2、板 3）进行比较，因此需额外两块板。[2]
那么有什么软件可以做到？
作为 qPCR 技术的主要制造商之一的 Bio-Rad 公司更加关注 qPCR 技术的整体解决方案和用户的使用体验，推出了集 qPCR 数据收集处理、统计学分析和数据可视化于一体的 Bio-Rad CFX Maestro 软件。
可以一键式对数据进行统计学分析并导出符合文献发表的高质量图表。相比过去 qPCR 软件获得实验数据后，还需导出至 Excel 等软件中进行计算、统计学分析，再借助 Graph Pad 软件作图，仅用 Bio-Rad CFX Maestro 一个软件即可完成所有 qPCR 数据分析流程。
大大简化了流程，提高了效率，降低出错率。实现了一站式的解决方案，轻松完成实验后期数据分析工作。
图 4. Bio-Rad CFX Maestro 软件用户界面
那么 Bio-Rad CFX Maestro 软件的强大功能有哪些呢？
一、便捷的反应板设置和参考基因选择
快速设置技术重复和生物学重复
Bio-Rad CFX Maestro 软件旨在帮您快速收集数据。使用视觉界面进行布板设置，该视觉界面会以不同颜色标识不同的样品孔以确认准确的设置。还可以同时设置技术重复和生物学重复。鉴别参考基因稳定性并筛选理想参考基因。
图 5. 快速可视化并确认布板设置。样本孔用不同颜色标记样本、生物学重复和技术重复
筛选您理想的参考基因
在进行基因表达分析时，稳定的参考基因是必不可少的。 Bio-Rad CFX Maestro 软件的参考基因选择工具将比较多个参考基因的稳定性，为您提供有关在整个实验过程中，哪些参考基因最有可能在所有样本中以一致水平进行表达的信息，有助于确保可靠的相对表达数据。
图 6. 自动识别理想参考基因，绿色标识部分基因稳定值越高其稳定性也越好，可作为理想的参考基因
整合 PrimePCR Assay 分析简化引物设计和实验设置
使用 Bio-Rad CFX Maestro 和 PrimePCR 即可轻松实现。将 PrimePCR 运行文件拖放到 Bio-Rad CFX Maestro 中，会自动导入布板设置和运行条件。实验运行后，通过查看 PCR 对照（阳性对照，RT，gDNA 和 RNA 质控对照）以确保运行质量。
图 7. Bio-Rad 有多种 PrimePCR Assay
二、一键式数据分析和统计学分析
自动计算 Cq 值和扩增效率
Bio-Rad CFX Maestro 软件具有查看、分析和解读数据的工具。可以为每个实验靶标自动设置基线及阈值线以计算 Cq 值，或者您可以通过单击并拖动阈值线自行调整阈值。如有标准曲线，Bio-Rad CFX Maestro 将自动计算扩增效率。
图 8. 实时记录每个样品的扩增曲线，并按靶标、样品类型或位置对它们进行颜色标识
轻松实现统计学分析
只需单击几下鼠标，您就可以对等位基因进行识别，查看均一化基因表达差异，进行 t 检验或方差分析。
高效开展多板合并分析
Bio-Rad CFX Maestro 软件还可以对多板数据进行自动化合并分析。使用基因研究功能可以将数十甚至数百个反应板整合进行统计学分析，而无需在其他软件中单独导出并组合分析大量独立数据。
图 9. 多板合并分析。聚类图显示根据基因表达水平相似性分组的共 24 个反应板合并分析结果
三、轻松导出用于文章发表的高质量图表
有多种结果可视化图表可选，包括柱形图，箱线图，聚类图和火山图等以及对图形进行编辑和注释，以用于发表或演示。可以更改颜色、字体、标题和图例。
并用 P 值、文本和箭头注释图形以标识特定数据，也可以任意设置图形大小和分辨率，最后以 .jpg、.png 或 .bmp 等格式生成漂亮的数据图形。
图 10. 基因相对表达水平（柱状图），还可以用 P 值注释以标记具有统计学意义的数据
图 11. 火山图支持快速鉴别出其表达水平差异具有统计学意义的目的基因
四、与 CFX Opus 仪器配合使用，兼容高通量检测
CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统特点：
✔ 先进的光学设计，确保光学测量参数一致
✔ 精准的温控系统
✔ 2～5 靶标多重检测
✔ 动态温度梯度功能以快速优化实验条件
Bio-Rad CFX Maestro 软件和 CFX Opus仪器可与 LIMS 及自动化系统进行整合实现高通量并导出数据到指定的 LIMS 文件夹，运行完成后可远程邮件通知并附带数据文件，还可以进行多仪器平行连接控制。
此外可以利用应用程序接口（application programmers interface，API）的参考指南，与自动化系统无缝配置。
CFX Maestro 软件，化繁为简，发现 qPCR 结果之美！
* BIO-RAD 是「BIO-RAD LABORATORIES, INC.」在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。
参考文献：
[1]. Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The ultimate qPCR experiment: producing publication quality, reproducible data the first time[J]. Trends in biotechnology, 2019.
[2]. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A.et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol 8, R19 (2007). https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-2-r19
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