刚来的小师弟课题做了大半年，做到病毒蚀斑测定实验时，不是没有形成蚀斑，就是细胞大片死亡无法计数蚀斑数量，迟迟没有进展。几次失败惹得老板组会上大怒，指派大师兄带着师弟一起做。

大师兄会后在查阅文献资料时，发现了一种新的蚀斑测定方法，通过收集明场和荧光信号，可以拿到精确可靠的数据，整个过程操作简单，结果直观可信。

下面一起来看一下新方法是怎么做的：

2021 年美国德克萨斯生物研究所在 PNAS 上发表研究，构建了表达报告基因 Venus 的重组 SARS-CoV-2 病毒，用于研究病毒的感染、传播、发病机制和体内治疗 SARS-CoV-2 的治疗干预措施。利用重组病毒感染细胞的上清去做蚀斑实验，Venus 和 N 蛋白抗体的荧光可以很容易地用荧光成像系统检测到。

此外在验证重组病毒的稳定性时，研究人员即使将病毒在 Vero E6 细胞中传代 7 次后，取上清液进行蚀斑分析，报告基因的荧光也能很好的被凝胶成像系统检测到。利用凝胶成像系统直接检测报告基因荧光或者抗体荧光来分析病毒的体外特征，操作更为简单，数据直观准确。


 

图 1：使用 ChemiDoc MP 成像系统检测荧光斑块（PNAS 网站）
 

1. 蚀斑测定实验原理：

病毒感染细胞后由于固体介质的限制，释放的病毒扩展范围有限，只能形成一个局限性的细胞病变区，也就是蚀斑。对于蚀斑测定实验，过去通常利用结晶紫、中性红等染料浸染琼脂层，通过显微镜或肉眼观察计数细胞噬斑数量来确定病毒的感染情况和滴度等，是一种间接且操作繁琐的方法。

2. 传统方法的局限性

从理论上讲，病毒蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而蚀斑实验常用于病毒颗粒的计数和病毒克隆的分离，但在实际的操作过程中常常会出现几个病毒颗粒感染同一个细胞的情况。影响滴定的准确性和克隆的单一性。

另外噬斑需要利用肉眼或者显微镜计数，对于一些蚀斑形成不明显的病毒来说，存在一定的技术难度，容易产生实验误差。

3. 荧光蚀斑测定技术

与传统方法不同的是，在蚀斑实验中研究者通过检测报告基因以及相应的病毒蛋白的荧光抗体的荧光位置和荧光强度，来分析病毒的感染情况。

利用抗体直接标记病毒蛋白，可以标记不同的蛋白增加实验结果的可信度。

荧光效率高，标记后下降不明显，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，实验结果便于定量分析。

经过全能型成像系统采集荧光强度分析病毒感染情况，搭配高灵敏度的荧光染料，会使实验操作更为简洁，实验结果的计算更为精确，数据更加可靠。

荧光信号及明场信号可以用 Bio-Rad 公司 ChemiDoc MP 全能型成像系统轻松获得。没想到我们实验室一直用来做凝胶成像的 ChemiDoc MP 成像仪竟然有这样优异的功能。除此之外，ChemiDoc MP 的荧光还有更多的应用和优势：

① 支持荧光和化学发光成像，支持可见光到近红外范围的多种荧光标记抗体检测，最多 5 个通道同时检测荧光信号；

 

② 搭配高灵敏度的 StarBright 荧光标记染料和 ChemiDoc MP 系统及免染（Stain-Free）总蛋白定量归一化技术，令您获得更加准确的定量结果同时不需要过多额外的优化实验。

功能强大，性能可靠！

当然，该成像系统不仅在蚀斑测定实验中能发挥大作用，在 WB 实验中也发挥着强大功能：

Bio-Rad 不仅仅提供成像系统，从样品制备、电泳、转印，再到免疫检测和图像的检测和分析，Bio-Rad 提供 Western Blot 的全流程支持，点击「阅读原文」了解更多信息。

 

注：

1. 本产品仅限科研使用，不作为临床诊断。

2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
 

参考文献：

[1] Ye C, Chiem K, Park JG, Silvas JA, Morales Vasquez D, Sourimant J, Lin MJ, Greninger AL, Plemper RK, Torrelles JB, Kobie JJ, Walter MR, de la Torre JC, Martinez-Sobrido L. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Oct 12;118(41):e2111593118. doi: 10.1073/pnas.2111593118. PMID: 34561300; PMCID: PMC8521683.