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WB 一个月都没出结果,你的步骤错在哪里?(文内干货)
人阅读 发布时间:2023-05-31 16:58
大清早伴着实验室的哀叹,小师妹肝了一个月的 WB 实验又双叒叕失败了。
投稿的杂志要求上传 WB 原图,且对 WB 图片质量要求极高。看着空白一片、乌七八黑、歪歪扭扭的 WB 结果图,真是令人头秃……
此时,大师兄指出一条明路:要关注 WB 实验中的电泳和转印过程!
令人头秃的结果图(图源:用户提供)
Western Blot 实验作为生物医药研究领域的常客,却是罕见的「玄学」操作,向来是易做难精、难出漂亮图。每一个生物科研狗,都有着一本厚如板砖的 WB 操作血泪史。即使从蛋白制样开始,每个环节都小心谨慎,最后显影环节也可能是一场空。尤其是其中的电泳和转印过程,看起来简单朴实,但是却很容易出现问题。
尽管 WB 实验这么玄乎,但是很多坑也是可以规避的。电泳和转印,这两步操作是后续环节的基础。顺利高效地完成它们,你的 WB 实验将事半功倍!下面为大家整理了这两步的注意事项,需要的同学可以截图保存,后面就不要出错了。
电泳的注意事项
1. 选择合适的制胶装置:当凝胶和玻璃挡板底部有气泡或两边聚合不完全时,跑出条带常呈「皱眉状」。
2. 选择精确的电源系统:当你的条带呈「笑脸状」时,你的内心却是 emo 的。电泳系统温度高,且电场强度过大时,会导致条带弯曲。
3. 设置合理的电压:小电压能够使胶的分子筛效应充分发挥,在某些实验体系中,电压越小,条带跑得越漂亮。浓缩胶和分离胶分别跑 55V 和 75V,即使花费时间长,得到的条带却会让你觉得人间值得!
4. 控制上样量:上样量过多,将会导致其弥散至孔周围。在电泳时将造成条带两边扩散,建议减少上样量或者使用 5X 上样缓冲液。
转印的注意事项
1. 防止转膜液过热:发热造成胶变形、分子扩散。在转膜前将转膜缓冲液提前置于 4℃ 冷却,将转膜装置放在冰浴或 4℃ 冰箱里进行转印。
2. 赶走气泡:转膜后胶上有单个或多个白点,造成转膜效果差,这是因为膜和胶间存在气泡。制作三明治时应充分赶走气泡,以免影响后续转膜。
3. 充分转膜:当膜没有完全均匀湿透、靶蛋白分子量较小、转膜 buffer 中甲醇含量过高及转膜时间短时,均能造成转膜不充分。此时应分别增加浸泡活化的时间、选择小孔径的膜、降低甲醇浓度及延长转膜时间,以达到充分转膜的效果。
获得一张漂亮、发表级的 WB 图并不容易,每个实验室和科研工作者也有自己独特的 tips。
除了在实验步骤上多下功夫,一款好用的 WB 电泳仪也尤为关键,能够助力 WB 实验高效进行。Bio-Rad 的电泳产品,助力你的 WB 实验图瞬间俘获审稿人的芳心,让你按时毕业,不头秃!
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*Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories,Ins 在特定区域的商标。
*相关产品仅可用于科研,不可作临床诊断使用。