不过。一顿操作之后去质检，要么被降解浓度低，要么溶液中蛋白或酚类物质残留过多（心如死灰 .jpg）……好不容易纯化到了质量合格的 RNA，接下来反转录的可千万别出岔子啊。

 

跟我们谈笑风生还能提得一手好 RNA 的师兄偷偷告诉我他做好 RT-qPCR 的秘诀是「一靠谱三注意」。

 

「一靠谱」首先要有靠谱的 RT-qPCR 实验试剂。Bio-Rad 倾情推荐 RT-qPCR 实验系列好物, 让您实验开挂事半功倍。

 

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「三注意」mRNA 为模板合成互补的 DNA 有 3 个需要重点考虑的因素，即反转录引物的策略、反转录酶的属性、RT 动态范围及重复性。

 

01 反转录引物的策略

 

通常引物策略有 3 种：

 

Oligo（dT）：

 

Oligo（dT）是由约 12～18 个多聚胸腺嘧啶 T 碱基连接而成的寡聚引物，适用于有 Poly（A）尾的 RNA。绝大多数真核生物 mRNA 具有 3' 端 Poly（A）尾，此引物可与其配对，仅 mRNA 可被转录，因此具有较高的特异性。但对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。

 

 

随机引物：

 

随机引物是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组， mRNA，rRNA，tRNA 均可以作为模板进行逆转录，模板丰度很低的情况也适用。当目标区域具有复杂二级结构、GC 含量较高或者模板来源于原核生物时，即可使用随机引物。但结合的随机性会造成 cDNA 小片段和非目标基因 cDNA 太多，有时候还会对微量目的片段造成稀释，可能会影响低丰度基因扩增。

 

 

特异性引物：

 

特异性引物为与模板序列特异性互补的引物，适用于目的基因序列已知的情况，可用于一步法 RT-PCR。在实际的应用中，通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化。
 

 

不同引物的合成策略有所差异，让本就摸不着门路的新手小白更糊涂了。有没有适合多场景的「万金油」解救一下啊！

 

伯乐 iScript Select cDNA 的反转录预混液中可提供多种不同的引物（oligodT、随机引物、以及 oligodT 与随机引物的结合）的合成策略，扩增引物设计区域灵活，3’ 端还是 5’ 端区域均可考虑。同时可以生成长链 cDNA，更有利于下一步的 PCR 过程。

 

▲ iScript Select cDNA 合成试剂盒有助于合成长度超过 6 kb 的 cDNA

 

 

02 逆转录酶的属性

 

逆转录酶常见的有两种，分别是 MMLV RNase H+ 和 RNase H-。

 

RNase H 是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解 DNA-RNA 杂合链中的 mRNA，不水解单链或双链 DNA 及 RNA。所以 RNase H+ 活性能控制 RNA : cDNA 比率，在扩增效率一致的情况下，能够真实反应原始 mRNA 中基因丰度 / 表达量等信息。

 

RNase H- 的逆转录酶可以合成多拷贝的 cDNA，但是会导致模板基因表达量的失真。

 

 

与其他两种常用逆转录酶相比，伯乐 iScript Select Kit 表现出卓越的保真度，且 cDNA > 8 Kb。

 

 

03 RT 动态范围及重复性

 

而对于难扩增基因和低丰度基因，采用具有更大的动态检测范围的预混液更为适合。iScript™ Select cDNA 合成试剂盒使用任何第一链引物方法都能稳定的超过六个数量级。此外伯乐在出厂前通过梯度稀释实验来检测反转录效率一致性，确保 cDNA 合成预混液的优异性能。

 

工欲善其事必先利其器，有 3 个关键环节把关严格且保证高效的 iScript™ Select cDNA 合成试剂盒做后盾，还愁实验不成功亏一篑？

 

iScript cDNA 逆转录试剂盒主要特点和优势：

 

 

 

实现高保真

独特的逆转录试剂盒可最大限度地减少碱基对错误的引入

 

合成长 cDNA

有效合成大于 8 kb 的 cDNA

 

在配置反应液的过程中节省时间并减少错误

与其他高保真逆转录酶试剂盒的方案相比，更少的手动操作时间和更少的移液步骤

 

检测低水平靶基因并保存 RNA

总 RNA（1 µg～1 pg）的宽线性动态范围与高效 RNase H+ MMLV 逆转录酶

 

避免 RNA 降解造成的数据偏差

RNaseA 抑制剂的强效混合物可在设置和逆转录过程中保护 RNA

 

 

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注：

1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。

2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标