荧光定量PCR（qPCR）是目前病原检测领域使用最为广泛的核酸检测方法，对于刚刚接触qPCR应用的小伙伴，很容易钻入了“唯Ct（Cq）值”的牛角尖。

一个常见的误区是Ct（Cq）值越小，检测灵敏度越高，但真的是这样吗？

一、基础知识回顾
 

1、基本概念：Threshold cycle (Ct) 阈值循环数也写作Cq值，在阈值线法下，荧光信号与阈值线交叉时的循环数为Ct。为了消除偶然误差，仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），在实际操作中也可以手动调节。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍，高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号。

 

Ct会受到阈值的影响，每次实验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值，也即Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同预混液、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。

 

2、模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，如下图，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。



 

3、检测灵敏度：也称为分析敏感性/检测限/最低检出限（LoD）等等，是指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样本中重复检测待检测物质的最小浓度或最小值。简而言之，检测灵敏度是可重复并可靠的检测到的最低浓度。

 

二、检测灵敏度如何确定

在《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》中建议的具体做法如下：
 

●   将含有SARS-CoV-2的真实临床样本/含有该病毒RNA片段的假病毒颗粒梯度稀释于(与适用样本一致的)适当基质中。

●   每个浓度梯度最少重复三次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度至少重复20次检测，将具有90%~95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检测限。

●   应至少包括不同来源的三个具有代表性的SARS-CoV-2做检测进行系列梯度稀释。


小结：
 

LoD的评估应该分2步进行，首先选择已知量值的模拟样品（DNA病毒为质粒或假病毒，RNA病毒为假病毒）或真实样品进行倍比稀释，每个浓度至少重复3遍，得到检测均为阳性的最低检测浓度。同时绘制标准曲线获得R^2和扩增效率（一般要求标准曲线至少5个数据点，R^2≥0.99，扩增效率在90%-110%）。其次在最低检测浓度附近制备若干浓度，20次重复，19次以上检测为阳性的浓度为该方法的最低检测限。

由此可见，最低检出限的确定与Ct值没关系。

需要注意的是不能无限稀释，因为低浓度下重复性结果不好，导致无法确定LoD。

 

3 结论

 

qPCR检验方法的评价需要从检测灵敏度（最低检测限）、特异性、重复性（精密度）、线性、扩增效率、动态范围等多个指标去衡量 。仅凭Ct（Cq）值的高低去判断所建立的检测方法有些片面，不同商业化试剂盒的Ct（Cq）值不具有可比性。

所以仅根据Ct（Cq）很难看出检测灵敏度，因为样本、核酸提取效率、PCR预混液、染料浓度、阈值、人员操作都跟Ct（Cq）有关，关键要看梯度稀释所能稳定检测到的最低稀释浓度。

 

参考资料：

1、原博士带你做检测：《做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！》 

2、李金明《实时荧光PCR的Ct值与病毒载量之间的关系》

3、Bulletin 11-348 荧光定量PCR应用指南